百典-恒温设备专家

全国咨询热线: 021-51877533
恒温设备专家
当前位置:百典仪器 >> 技术支持 >> 影响高效毛细管区带电泳色谱仪分离的操作条件

影响高效毛细管区带电泳色谱仪分离的操作条件

文章出处:百典科技责任编辑:admin发表时间:2016-09-05
影响高效毛细管区带电泳色谱仪分离的操作条件有缓冲液、添加剂、分离电压和分离温度等。 一、缓冲液: CZE分离过程在缓冲液中进行,缓冲液的选择直接影响粒子的迁移和分离。 配制缓冲液时,必须使用高纯蒸馏水和试剂。使用前要用0.45μm滤膜过滤以除去颗粒等。 1、缓冲液的选择须遵循的要求: (1)在所选择的pH范围内有很好的缓冲容量。 (2)在检测波长处无吸收或吸收值低。 (3)为达到有效的进样和合适的电泳淌度,缓冲液pH值至少与被测组分的等电点相差l个pH单位。 (4)自身淌度低,即分子大而荷电小,以减少电流的产生。 (5)只要条件允许,尽可能采用酸性缓冲液。在低pH值下,吸附和电渗流都很小,毛细管涂层的寿命较长。 (6)与毛细管种类匹配,涂层毛细管只能在一定pH范围内使用。 2、常用缓冲液: 常用缓冲液有硼砂、磷酸盐、柠檬酸盐、琥珀酸盐和醋酸盐等。 3、缓冲液pH值: (1)缓冲液pH值的选择与样品性质有关。 1)通常酸性组分选择在碱性条件下分离。 2)通常碱性组分选择在酸性条件下分离。 3)蛋白质、多肽和氨基酸等两性物质可选酸性(pH = 2)或碱性(pH>9)分离介质。 4)糖类样品通常在pH = 9~11能获得最优分离。 5)羧酸或其它样品多在pH = 5~9选择分离条件。 (2)缓冲液pH值的选择和毛细管种类有关。 很多涂层毛细管只能在一定pH范围内使用,如聚丙烯酰胺涂层毛细管只能在pH = 4~9使用,否则涂层易水解失效。 (3)在相同pH下,不同缓冲液的分离效果可能相差很大。 一般来说,能与样品发生相互作用的试剂可能是最好的。如分离糖类和DNA等分子时应优先使用硼酸盐缓冲液,因为硼酸根能与糖羟基形成配位键,增加糖的负电荷和分离度。硼酸盐缓冲液也适用于分离其它含邻羟基和多羟基的化合物。 (4)为了选择合适的pH值,需要用pH调节剂调整介质的酸碱性。 由于多数缓冲试剂是酸性物质如磷酸,所以pH调节剂主要是碱类。常用pH调节剂有NaOH、KOH和Tris等。也可用胺和醇胺等有机碱如乙醇胺和乙二胺。如果缓冲试剂为碱类,可用酸作为调节剂,尽量使用弱酸如H3PO4。 缓冲试剂和调节剂的浓度对改善分离、抑制吸附和控制焦耳热等都有影响。一般缓冲试剂的浓度在10~200mmol/L,有时为了抑制蛋白质等的吸附作用,浓度可高达500mmol/L(此时应减少分离电压)。电导率大的缓冲试剂如磷酸盐和硼酸盐等的浓度一般在20mmol/L,电导率小的缓冲试剂如硼酸的浓度可在100mmol/L以上。 二、添加剂: 如果缓冲液经各种参数优化后仍无法给出良好的分离结果,可加入添加剂以改善分离。常用添加剂有: 1、无机电解质:NaCl和KCl等。 2、有机溶剂:甲醇和乙腈等。 3、非电解质高分子:纤维素、多糖、聚乙烯醇和Triton X-100等。 4.、功能性添加剂:手性冠醚和环糊精等。 三、分离电压: 分离效率与电压间存在极大值。极大电压通常也是最优工作电压。 当毛细管很细或缓冲液电导很低时,极大电压可能会超出仪器范围。此时没有最优电压,可选择仪器允许的最大输出电压。 当毛细管较粗或缓冲液电导较高时,极大电压可能很小,若此时分离度很高,可选择大于极大值的电压进行分离。 四、分离温度: 毛细管的温度不仅影响分离的重视性,而且影响分离效率。温度选择应考虑热效应、分析重现性、分离效率和分离介质对温度的限制等因素。 温度应通过实验确定。多数情况下,在20~30℃进行电泳能获得良好的分离效果。一些糖类样品需要高于室温的分离条件,一些样品如蛋白质等可能需要低于室温的分离条件。

相关资讯

推荐商品